http://members.cox.net/amgough/FISH_olgio_hybridization-deep01_01_03.jpg

DNS hibridizáció

Szerző:
KÖRINFO

A címekre kattintva megtekinthetjük az adott képhez tartozó részletes leírást, a képekre kattintva diavetítés indul.

A DNS–DNS-, illetve DNS–RNS-hibridizáció arra a molekuláris-biológiai technikára utal, ami két nukleotid-szekvencia közötti hasonlóság eredményeképpen létrejövő kapcsolaton alapul. A kapcsolódás ténye és mértéke bizonyítja a hasonlóságot vagy azonosságot.  Konkrtét gének vagy DNS-szekvenciák jelenlétének bizonyítására vagy különböző eredetű DNS-ek, például  fajok vagy egyedek genetikai távolságának meghatározására használják. A hasonlósűágon vagy azonosságon alapuló kapcsolódás mellett még két feltételnek kell teljesülnie: a vizsgálandó mintát rögzítenünk kell, a hozzátett próbát pedig könnyen követhető jelzéssel kell ellátni. 

Ha több fajt hasonlítanak így össze, a hasonlósági értékek felhasználásával lehetővé válik a filogenetikai fa  (evolúciós elágazásrendszer) felállítása; így ez a molekuláris rendszertan művelésének egyik módszere.

A folyamat a következőképpen zajlik le. Az összehasonlítandó fajok DNS-ét először kivonják, majd megtisztítják. Eztán a DNS-t rövid szakaszokra tördelik. Ezeknek a fragmentumoknak az elegyét felforralják, majd 50 °C-ra hűtik, ahol az ismétlődő szekvenciák már hibridizálnak, de az scnDNA (egypéldányos kódoló szakasz) nagyobbrészt egyszálú marad. Ezután az oldatot hidroxiapatit-oszlopon vezetik keresztül, ami csak a kettős szálú DNS-t (azaz ezen a ponton a repetitív szekvenciákat) köti meg. Az oszlopról lejövő egyes szálakat megjelölik (radioaktív izotópot (32P, 3H, 14C) vagy kovalens kötéssel színreakciót biztosító molekulatöredéket, esetleg specifikus ellenanyaggal detektálható csoportot építve a nukleinsavba), majd nagy mennyiségű jelöletlen DNS-t adnak hozzá. Ez utóbbi származhat a mintával megegyező fajból, vagy egy másik fajból. Néhány napig 60 °C-on tartják a keveréket, ez alatt a hasonló szekvenciájú szálak hibridizálódnak. A jelöletlen szálak óriási feleslege miatt a hibrid molekulák vagy teljesen jelöletlenek, vagy az egyik szálukon jelölt, a másikon jelöletlenek lesznek. A mintát ezután újra hidroxiapatit oszlopra viszik fel. Az oszlopot vízfürdőben melegítik 2,5 °C-onként a 60-90 °C-os hőmérsékleti tartományon belül. Minden emelés után lemossák az oszlopról a denaturált DNS-szálakat, azok mennyiségét a hőmérséklet függvényében ábrázolják. A kapott függvény a termikus elúciós profil, amely statisztikai elemzések kiindulópontja.

Egy gyakran alkalmazott eljárás szerint az elúciós profilból kiszámítják azt a hőmérsékleti értéket, amelyen a duplex DNS molekulák fele különválik (Tm = „olvadási hőmérséklet”). Az ugyanabból a fajból származó (homoduplex) DNS molekulák és a hibridizált molekulák (heteroduplex) olvadási hőmérsékletének különbsége, a ΔTm jellemzi a hasonlóság mértékét.